第一件事：質(zhì)譜可以檢測(cè)蛋白類藥物嗎？

隨著蛋白類藥物研發(fā)的快速發(fā)展，其檢測(cè)需求也日趨增多。免疫分析法是檢測(cè)該類藥物的常規(guī)方法，其具有靈敏度高和專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一定的局限性，比如相對(duì)較窄的線性范圍，方法精密度和重現(xiàn)性相對(duì)不佳，以及較大的基質(zhì)干擾，這些在一定程度上影響了蛋白類藥物檢測(cè)的準(zhǔn)確性。由于蛋白類藥物分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)質(zhì)譜分析儀器的質(zhì)荷比檢測(cè)上限，因此不能直接對(duì)該類藥物進(jìn)行檢測(cè)。目前常規(guī)方法主要是通過(guò)將蛋白類藥物變性、還原、烷基化，然后使用蛋白酶裂解，形成特征性的肽段，這些肽段具有良好的色譜和電離特性，幾乎無(wú)復(fù)雜的氨基酸殘基或修飾，能夠呈現(xiàn)線性和精確的響應(yīng)。

第二件事：哪些蛋白類藥物可以使用質(zhì)譜檢測(cè)？

蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元是氨基酸，構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的氨基酸有20多種。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中化學(xué)鍵包括共價(jià)鍵與非共價(jià)鍵，共價(jià)鍵有肽鍵和二硫鍵，非共價(jià)鍵有氫鍵、疏水鍵、離子鍵、范德華力與配位鍵等。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可分為一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)為初級(jí)結(jié)構(gòu)，二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)為高級(jí)結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的化學(xué)降解與溫度、pH值、離子強(qiáng)度和氧化劑的存在等密切相關(guān)，也與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有關(guān)。蛋白類藥物主要分為四類：

第一類：應(yīng)用蛋白質(zhì)的酶活性及調(diào)節(jié)活性進(jìn)行治療的蛋白質(zhì)藥物。該類藥物多為功能活性明確、作用位點(diǎn)清楚的蛋白分子。目前已經(jīng)上市的非抗體類重組 蛋白質(zhì)藥物均屬于此 類，可 細(xì) 分 為 以 下３組：

ａ）替代缺乏或異常的蛋白質(zhì)：因?yàn)樵S多疾病是由于特定的蛋白缺乏或異常引起的。本組藥物通過(guò)持續(xù)給予該蛋白，治療由確定的分子病因?qū)W造成的內(nèi)分泌及代謝性疾病，如治療由于激素缺乏的胰島素、生長(zhǎng)激素等。

ｂ）增強(qiáng)蛋白質(zhì)生物活性通路的藥物：主要通過(guò)增強(qiáng)血液或內(nèi)分泌通路或增強(qiáng)免疫反應(yīng)來(lái)達(dá)到治療作用。本組藥物主要為人體 內(nèi)正常情況下存在的細(xì)胞因子、內(nèi)分泌激素、凝血酶類分子或它們的類似物等，具有微量強(qiáng)效、作用快速等特點(diǎn)。

ｃ）提供新功能或新活性的蛋白藥物：使用天然存在的蛋白質(zhì)來(lái)治療人類病理生理學(xué)疾病，如對(duì)大分子酶促降解的膠原酶、透明質(zhì)酸酶和阿法鏈道酶，對(duì)小分子代謝物酶促降解的PEG修飾。

第二類：有特殊靶向活性的蛋白質(zhì)治療藥物。本類藥物以單克隆抗體、免疫球蛋白相關(guān)分子為主。

ａ）直接干擾靶分子或靶組織功能的蛋白。主要是各種治療性抗體，如利妥昔單抗、曲妥珠單抗、貝伐單抗、英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗等。

ｂ）傳遞其他化合物的藥物：該類藥物利用蛋白質(zhì)可特異性結(jié)合治療靶點(diǎn)的能力，借助蛋白質(zhì)為傳輸載體，將高毒性的小分子藥物、毒素或同位素等效應(yīng)分子靶向運(yùn)送至疾病部位 從 而 發(fā) 揮 治 療作用。

第三類：蛋白或多肽疫苗。伴隨蛋白或多肽疫苗制造技術(shù)的發(fā)展，“治療性疫苗”的理論及應(yīng)用不斷成熟，從本質(zhì)上改變了傳統(tǒng)疫苗的概念。無(wú)論從研發(fā)手段、生產(chǎn)工藝，還是從產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)量控制等角度，蛋白或多肽疫苗與蛋白質(zhì)藥物已經(jīng)沒(méi)有區(qū)別。因此將蛋白或多肽疫苗歸為蛋白質(zhì)藥物范疇是一種必然趨勢(shì)。

第四類：用于診斷的重組蛋白質(zhì)藥物。該類重組蛋白質(zhì)藥物兼有藥物及診斷試劑的雙重功能，可用于某些特定疾病的體外及體內(nèi)診斷，如腫瘤顯像劑多用抗體偶聯(lián)同位素，在腫瘤 定位診斷的同時(shí)，同位素也可能對(duì)瘤細(xì)胞發(fā)揮抑制或殺傷作用。

第三件事：與傳統(tǒng)配體結(jié)合方法（Ligand binding assay ，LBA）比較，質(zhì)譜技術(shù)有哪些優(yōu)勢(shì)？

經(jīng)典的蛋白質(zhì)藥物定量分析采用LBA技術(shù)，其中以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）為代表，該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是對(duì)儀器設(shè)備要求低、易于操 作以及靈敏度高。但是也存在一定的缺點(diǎn)，例如：方法建立時(shí)間長(zhǎng)、受內(nèi)源性抗體的干擾、定量范圍窄、非特異性結(jié)合以及交叉免疫等。近年來(lái)備受關(guān)注的質(zhì)譜技術(shù)，在蛋白藥物定量分析中，具有良好的選擇性、準(zhǔn)確性、精確性、定量范圍寬、開(kāi)發(fā)時(shí)間短（約幾周時(shí)間）、分析通量高以及多重分析能力的優(yōu)點(diǎn)。與 LBA方法相比，質(zhì)譜技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)：

第一，質(zhì)譜方法開(kāi)發(fā)的步驟包括質(zhì)譜和液相方法的建立、樣品的前處理、方法學(xué)驗(yàn)證，這些步驟耗時(shí)短，一般只需要2-4周，耗費(fèi)成本也低。相反，LBA方法開(kāi)發(fā)的步驟包括關(guān)鍵試劑的優(yōu)化、內(nèi)源性干擾物質(zhì)的檢查、不同來(lái)源樣品的交叉驗(yàn)證。建立LBA方法需要開(kāi)發(fā)關(guān)鍵試劑，要耗費(fèi)大量的時(shí)間，而且耗費(fèi)成本較高。

第二，質(zhì)譜方法使用同位素標(biāo)記的肽段或蛋白質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)，可以有效地校正分析過(guò)程中的偏差和基質(zhì)效應(yīng)。只要正確的維護(hù)儀器和執(zhí)行相關(guān)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)譜方法是非常穩(wěn)定，而LBA的關(guān)鍵試劑都是通過(guò)生物過(guò)程產(chǎn)生的，容易受到蛋白質(zhì)翻譯后修飾等因素的 干擾，而且LBA方法難以使用內(nèi)標(biāo)來(lái)糾正定量偏差，很難保持較高的批間／實(shí)驗(yàn)室間的一致性。

第三，質(zhì)譜方法通過(guò)色譜分離和同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物的校正可以最大程度地降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，并且能夠適用于不同的生物基質(zhì)，因此可以同時(shí)開(kāi)發(fā)出應(yīng)用于不同組織和器官的方法，用以定量其中藥物濃度。相反，LBA方法很難應(yīng)用在不同的基質(zhì)（血漿或組織）以及不同的物種之間，不同的基質(zhì)成分引起的干擾和交叉反應(yīng)非常明顯，對(duì)LBA的特異性有很大的影響。

最后，質(zhì)譜可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)待測(cè)物，特異性強(qiáng)，能很好的避免基質(zhì)干擾，特別適用于一些受到內(nèi)源干擾很強(qiáng)的項(xiàng)目，此外，還擁有較寬的線性范圍。而LBA一般很難同時(shí)檢測(cè)多個(gè)待測(cè)物，線性范圍也相對(duì)較窄，也易受到內(nèi)源干擾的影響。

第四件事：質(zhì)譜檢測(cè)蛋白類藥物的一般步驟有哪些？

如圖1所示，目前常規(guī)的方法主要是通過(guò)將蛋白類藥物變性、還原、烷基化，使用蛋白酶裂解以形成特征性的肽段，最后篩選響應(yīng)高、干擾低的特異性肽段進(jìn)行檢測(cè)。由于蛋白類藥物多重的空間結(jié)構(gòu)，需要進(jìn)行打開(kāi)空間結(jié)構(gòu)。常見(jiàn)的變性方式主要有高溫、添加有機(jī)試劑、強(qiáng)酸、鹽類以及其他的蛋白質(zhì)變性劑。此處特別注意添加變性劑對(duì)于后續(xù)蛋白酶活性的影響。蛋白類藥物結(jié)構(gòu)中含有二硫鍵，需要打開(kāi)二硫鍵和保護(hù)巰基避免二聚體形成。常規(guī)的還原試劑包括DTT和TCEP，烷基化試劑包括碘乙酰胺。這里需要關(guān)注反應(yīng)條件（pH和溫度）。酶解過(guò)程是蛋白質(zhì)藥物檢測(cè)最關(guān)鍵的步驟，大部分藥物都可以使用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，主要作用賴氨酸和精氨酸的羧基端。酶解產(chǎn)生很多片段我們需要同蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，篩選出特異性片段，一般選擇可變區(qū)域的片段作為候選肽段。

圖1

第五件事：有質(zhì)譜檢測(cè)蛋白類藥物成功的案例？

目前熙寧生物質(zhì)譜平臺(tái)基于LC-MS已開(kāi)發(fā)出檢測(cè)英夫利西單抗、新冠中和抗體、帕博利珠單抗等蛋白質(zhì)類藥物的方法，并成功應(yīng)用臨床樣品檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，質(zhì)譜檢測(cè)蛋白類藥物擁有非常高的精密度、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，且臨床試驗(yàn)樣品再分析（ISR）結(jié)果高達(dá)99%以上，體現(xiàn)出特別出色的方法可靠性。

結(jié)束語(yǔ)

熙寧生物質(zhì)譜平臺(tái)能夠提供符合NMPA/FDA/OECD/EMA的各項(xiàng)生物樣品分析服務(wù)，支持小分子藥物、多肽、寡核苷酸、PROTAC、ADC以及大分子抗體等藥物的方法開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證和樣品檢測(cè)。平臺(tái)配備了多套高端液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)和Watson LIMS在內(nèi)的生物分析系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)，各種先進(jìn)輔助設(shè)備，不僅可以滿足各型實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)需求，還大大提高實(shí)驗(yàn)效率和質(zhì)量，更高效地幫助客戶完成藥品研發(fā)。

參考文獻(xiàn)：

1. Fu Wei, Chen Qian, An Bo. Qualitative and quantitative characterization of protein biotherapeutics with liquid chromatography mass spectrometry[J]. Chin Hosp Pharm. 2019 Aug;39(16):1703-1708.